云南阿利新蓝染色方法

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一、染色原理

云南阿利新蓝染色是显示组织中酸性粘液物质最特异的经典染色方法。阿利新蓝是一种类铜钛花青共轭染料，属于阳离子染料。其原理基于染料分子中带正电荷的异硫脲基通过静电作用与组织内含有的阴离子基团形成不溶性复合物，从而使酸性粘液物质呈蓝色。

阿利新蓝染色的核心优势在于利用不同pH值的染液区分酸性粘液物质的类别：

pH 2.5：组织内的羧基电离，带有一个负电荷，与阿利新蓝中的阳离子形成盐键，使带有羧基的组织染为蓝色。

pH 1.0：组织内的硫酸根电离，带有一个负电荷，与阿利新蓝中的阳离子形成盐键，使带有硫酸根的组织染为蓝色。

中性黏蛋白不能与阿利新蓝反应。阿利新蓝染色广泛应用于黏液性疾病的鉴别诊断、软骨组织染色、早幼粒细胞和巨核细胞染色，以及AB-PAS联合染色区分酸性和中性粘液物质等领域。

二、实验步骤：

1、切片脱蜡至水

2、酸化处理

将切片浸入现配的Alcian酸化工作液中，室温浸泡3～5分钟。为阿利新蓝染色创造适宜的酸性环境。

3、阿利新蓝染色

取出切片，不经水洗，直接浸入阿利新蓝染色液中。

染色时间：

室温染色：25～40分钟（常用30分钟）

若使用37℃温箱染色，可缩短至15分钟。染色过程中可根据实验要求调整染色时间。

4、洗涤

流水冲洗5～10分钟。或蒸馏水洗3次，每次1～2分钟。

5、细胞核复染

滴加核固红染色液，室温染色5～10分钟。核固红可以不染。

流水冲洗1分钟。

6、脱水、透明与封片

70%乙醇 10秒 → 80%乙醇 10秒 → 90%乙醇 10秒 → 无水乙醇 10秒。

二甲苯透明（2×3～5分钟）。

滴加云南中性树胶，缓慢盖上盖玻片（避免气泡），封片。

三、结果判定

使用光学显微镜观察拍照。

酸性黏蛋白→蓝色    

蛋白多糖和透明质酸→蓝色    

细胞核→红色（核固红复染）    

背景/其他组织→淡粉色或无色  

四、注意事项

1、pH值选择决定染色特异性

利用染液的不同pH值可区分粘液物质的类属：

pH 2.5 ：使带有羧基的组织染为蓝色。

pH 1.0 ：使带有硫酸根的组织染为蓝色。

若要选择性鉴别硫酸黏蛋白和蛋白多糖，应使用pH 1.0的阿利新蓝，染色时间应相应延长。

2、酸化液现配现用

Alcian酸化工作液必须现配现用。不可提前配制久置。

3、固定液推荐10%云南中性福尔马林

固定液推荐采用10%中性福尔马林。其他固定液可能影响酸性粘液物质的保存和染色效果。

4、切片脱蜡须彻底

切片脱蜡应尽量干净，否则会影响染色效果。二甲苯需及时更换新鲜。

5、核固红复染可选

核固红可以不染。若需显示细胞核以辅助定位，推荐复染5～10分钟。核固红染色时间不宜过长，以免掩盖蓝色阳性信号。

6、试剂保存与使用

阿利新蓝染色液应室温避光保存。试剂开封后6个月内使用，每次使用后及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。

7、AB-PAS联合染色

阿利新蓝可与过碘酸雪夫（PAS）反应结合，用于区分酸性和中性粘液物质。AB-PAS联合染色中，糖原、中性黏蛋白、各种糖蛋白呈紫红色，酸性黏蛋白呈蓝色。

8、对照设置

阳性对照：使用已知含酸性粘液物质的组织同步染色，应呈蓝色。

阴性对照：使用已知不含酸性粘液物质的组织，或省略阿利新蓝染色步骤，应无蓝色信号

  

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